麻省總醫院(MGH)的一個研究小組報告說,近年來開發的幾種CRISPR堿基編輯器(靶向單個DNA堿基)會導致靶標DNA以外,RNA的大范圍脫靶效應。同時這一研究小組也研發了一種工程化新堿基編輯器,能顯著降低RNA編輯的發生率,提高靶標DNA編輯的精確度。

這一研究成果公布在4月17日的Nature雜志上。

“大多數關于脫靶基因編輯的調查都集中在DNA上,但我們發現這種技術也可以誘導大量的RNA改變,”文章通訊作者,MGH病理學系J. Keith Joung博士說,“這一令人驚訝的發現表明,當分析基因編輯在細胞中的意外脫靶效應時,不僅要考慮遺傳改變,在這篇文章中,我們通過構建選擇性減少脫靶RNA編輯的突變,來減少脫靶效應,同時保留預期的靶向DNA活性。”

與CRISPR-Cas基因編輯核酸酶(誘導靶向雙鏈DNA斷裂,進行遺傳改變)相反,CRISPR堿基編輯器能夠改變DNA鏈中單個核苷酸,且不會誘導斷裂。Joung解釋說,可以將CRISPR-Cas核酸酶比作分子剪刀,而堿基編輯則可以比作一支鉛筆。

融合蛋白利用經修飾的CRISPR-Cas指導靶標位點,堿基編輯則采用稱為脫氨酶的酶來修飾特定的核苷酸,誘導特定DNA發生變化,例如,將胞嘧啶變為胸腺嘧啶。

雖然大多數研究人員都專注于堿基編輯器的DNA編輯活性,但最常用的胞嘧啶-胸腺嘧啶編輯器中的脫氨酶最初是因其修飾RNA的能力而被鑒定的。因此MGH的研究人員開始調查它是否可能誘導脫靶RNA效應。

結果表明,肝臟和胚胎腎細胞系中的實驗證明雖然他們測試的常用編輯器在靶標DNA位點誘導了有效編輯,但也導致整個轉錄組中數萬個胞嘧啶-尿嘧啶發生編輯。而且當研究人員測試一種較新的腺嘌呤靶向堿基編輯時,他們也發現了類似的結果。

為了減少這種可能性,MGH的研究人員篩選了16個改良后的編輯器,發現了兩種與原始版本同樣具有有效誘導靶向DNA效應,又能顯著減少RNA編輯的編輯器。實際上,這些SECURE(SElective Curbing of Unwanted RNA Editing)甚至比未改變的脫氨酶更精確地誘導所需的DNA編輯。

文章作者,Julian Grünewald說,“我們也很高興看到我們可以通過SECURE堿基編輯器變體大幅減少那些不必要的RNA編輯。”

Joung表示,下一步他們將會調查這些RNA效應對CRISPR堿基編輯在實驗研究和臨床應用的潛在影響。

“我們發現,在一種人類細胞系中應用胞嘧啶堿基編輯器,會對細胞活力產生影響,而SECURE則不會。”

“我們目前正在嘗試設計SECURE腺嘌呤堿基編輯器,我們的目標是生成一套堿基編輯器,最小化RNA編輯,可用于研究和治療應用。”

編碼SECURE堿基編輯器的質粒可以查看http://www.addgene.org/crispr-cas.

來源:生物通